荧光定量PCR要领：染料法VS探针法

揭晓时间：2024-03-22 13:03

刚接触荧光定量PCR要领——TaqMan探针法时，不少人会有这样的疑问：为什么检测效果看不到溶化曲线？着实，溶化曲线是为了判断产品是否有非特异性扩增的一个侧面依据，适用于荧光染料法，但不适用于探针法。

一、QPCR原理

实时荧光定量PCR（QPCR）是通过在PCR反应系统中加入荧光基团，使用荧光信号的转变实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产品量的转变，通过 Ct值和标准曲线的剖析对起始模板举行定量剖析。凭证所用荧光化学物质的差别，可分为荧光染料法（SYBR GreenⅠ为代表）与探针法（TaqMan为代表）。

二、SYBR Green I 染料法

1. SYBR Green I 染料法原理：SYBR Green I是一种非对称花菁染料，能够团结于所有双链DNA双螺旋小沟区域，并不与单链DNA链团结。在游离状态下，SYBR Green I只能发出微弱的荧光，但与双链DNA团结后，荧光会大大增强。因此将SYBR Green I染料添加到PCR反应系统中时，SYBR Green I能够团结到模板和扩增产品发出荧光。随着每轮扩增，产品量呈指数型上升，荧光信号也随之累积并被仪器检测到。

图1 SYBR Green I 染料法作用机理

2. 溶化曲线：设置由低温到高温的程序，如一段由65℃逐渐升温到95℃的程序，随着温度逐渐升高，DNA双链逐渐解链为单链，嵌入到双链中的荧光染料分子也会逐渐脱落下来，荧光信号强度逐渐下降。当抵达DNA解链一半的温度，即抵达Tm值时，荧光染料会大宗游离出来，从而使荧光值迅速降低，最后转换成导数后形成岑岭。

染料可以插入任何双链DNA，包括引物二聚物和非特异性产品。SYBR Green I染料法是使用染料在DNA解链时释放不发射荧光，而在DNA双链时与其团结发射荧光的原理制作溶化曲线，使用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性子，通过熔点曲线剖析可以识别扩增产品和引物二聚体，因而区分非特异性扩增。

图2 溶化曲线

三、Taqman探针法

Taqman探针法原理：在PCR扩增反应加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针（Taqman探针），该探针5’端标记一个荧光染料报告基团（Reporter, R），3’端标记一个淬灭荧光基团(Quencher, Q)：

①最先时，探针完整地团结在DNA恣意一条单链上，报告基团（R）发射的荧光信号被淬灭基团（Q）吸收，检测不到荧光信号；

②PCR扩增时，Taq酶的核酸外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团（R）和淬灭基团（Q）疏散，从而发出荧光，切割下来的荧光分子数与PCR产品的数目成正比。因此，可以通过检测PCR反应系统中的荧光强度检测PCR产品的扩增量。

Taqman探针在PCR反应时其寡核苷酸链由于被DNA聚合酶的外切酶活性给切断，以是不会重新再团结形成探针，且特异性很高（特异性探针加特异性引物的团结的片断上爆发扩增才华网络荧光信号），以是不需要做溶化曲线。

图3 Taqman探针法作用机理

四、染料法VS探针法

（一）染料法

优点：

1、本钱较低，适合大规模的实验，可以做溶化曲线，剖析所有PCR产品的Tm值。

2、在实验设计阶段很是省时，由于它只需要合适的引物设计。

弱点：

1、特异性不是很高。染料可以插入任何双链DNA，包括引物二聚物和非特异性产品。

2、若是引物二聚体保存或者产品受到污染，获得的效果会不可靠。

3、更容易与低品貌的目的爆发非特异性荧光。

4、需要更多的时间举行效果剖析。

（二）探针法

优点：

1、更有可能只放大所需的产品，只有探针团结的片断上爆发扩增才华网络到信号。

2、不需要解离曲线，只有探针与准确的目的序列结适时才华检测到荧光。

3、由于具有特异性，数据更可靠。

4、数据剖析时节约时间。

对试剂生产厂家来说，探针法需要泯灭更长的时间去设计好引物和探针；但对试剂制品使用者而言，探针法没有显着的使用弱点。

suncitygroup太阳集团生物水产检测试剂接纳Taqman荧光探针法，特异性强、迅速度高，其检测限低至几个拷贝，更好地资助养殖企业相识目的病原体的携带情形、指导提前预防或及早检出，阻止造成较大经济损失。

	Taqman探针法	SYBR Green染料法
特异性	高	中（容易爆发假阳性）
迅速性	高	中
可重复性	高	中
通用性	-	√
多重反应	√	-
是否需要实验优化	-	√
探针/引物设计	探针+引物	引物
实验本钱	高	中
应用	特定基因表达差别剖析	特定基因表达差别剖析
	DNA定量	DNA定量
	SNPs基因剖析	-
	基因突变检测	-
	产前诊断（遗传病检测）	-
	熏染病早期病原体检测	-
	新药研发与药效评价	-
	miRNA定量剖析	-